Testiranje metilacije DNK v kombinaciji s pametnimi telefoni za zgodnje presejanje tumorjev in presejanje levkemije z natančnostjo 90,0 %!

Zgodnje odkrivanje raka na podlagi tekoče biopsije je nova smer odkrivanja in diagnostike raka, ki jo je v zadnjih letih predlagal ameriški Nacionalni inštitut za raka, z namenom zgodnjega odkrivanja raka ali celo predrakavih sprememb. Široko se uporablja kot nov biomarker za zgodnjo diagnozo različnih malignih obolenj, vključno s pljučnim rakom, gastrointestinalnimi tumorji, gliomi in ginekološkimi tumorji.

Pojav platform za identifikacijo biomarkerjev krajine metilacije (Methylscape) ima potencial za znatno izboljšanje obstoječega zgodnjega presejanja raka, tako da bolnike postavi v najzgodnejšo fazo zdravljenja.

Pred kratkim so raziskovalci razvili preprosto in neposredno zaznavno platformo za odkrivanje pokrajine metilacije, ki temelji na nanodelcih zlata (Cyst/AuNP), okrašenih s cisteaminom, v kombinaciji z biosenzorjem na osnovi pametnega telefona, ki omogoča hitro zgodnje pregledovanje širokega spektra tumorjev. Zgodnje presejanje za levkemijo je mogoče izvesti v 15 minutah po ekstrakciji DNK iz krvnega vzorca z natančnostjo 90,0 %. Naslov članka je Hitro odkrivanje rakave DNK v človeški krvi z uporabo AuNP s cisteaminom in pametnim telefonom, ki podpira strojno učenje.

Slika 1. Enostavno in hitro zaznavno platformo za presejanje raka prek komponent Cyst/AuNPs je mogoče doseči v dveh preprostih korakih.

To je prikazano na sliki 1. Najprej je bila za raztapljanje fragmentov DNK uporabljena vodna raztopina. Ciste/AuNP smo nato dodali mešani raztopini. Normalna in maligna DNK imata različne metilacijske lastnosti, kar ima za posledico fragmente DNK z različnimi vzorci samosestavljanja. Normalna DNK se ohlapno združuje in sčasoma združuje ciste/AuNP, kar ima za posledico rdečo zamaknjeno naravo cist/AuNP, tako da je mogoče s prostim očesom opaziti spremembo barve iz rdeče v vijolično. Nasprotno pa edinstven profil metilacije rakave DNK vodi do proizvodnje večjih skupin fragmentov DNK.

Slike plošč s 96 jamicami so bile posnete s kamero pametnega telefona. DNK raka so izmerili s pametnim telefonom, opremljenim s strojnim učenjem, v primerjavi z metodami, ki temeljijo na spektroskopiji.

Presejanje raka v vzorcih prave krvi

Da bi razširili uporabnost platforme za zaznavanje, so preiskovalci uporabili senzor, ki je uspešno razlikoval med normalno in rakavo DNK v resničnih vzorcih krvi. metilacijski vzorci na mestih CpG epigenetsko uravnavajo izražanje genov. Pri skoraj vseh vrstah raka so opazili, da se izmenjujejo spremembe v metilaciji DNA in s tem v izražanju genov, ki spodbujajo tumorogenezo.

Kot model za druge vrste raka, povezane z metilacijo DNA, so raziskovalci uporabili vzorce krvi bolnikov z levkemijo in zdravih kontrol, da bi raziskali učinkovitost pokrajine metilacije pri razlikovanju levkemičnega raka. Ta krajinski biomarker metilacije ne le prekaša obstoječe metode hitrega odkrivanja levkemije, ampak tudi dokazuje izvedljivost razširitve na zgodnje odkrivanje širokega spektra raka z uporabo tega preprostega in enostavnega testa.

Analizirana je bila DNK vzorcev krvi 31 bolnikov z levkemijo in 12 zdravih posameznikov. kot je prikazano v okvirčku na sliki 2a, je bila relativna absorbanca vzorcev raka (ΔA650/525) nižja kot pri DNK iz običajnih vzorcev. to je bilo predvsem posledica povečane hidrofobnosti, ki je povzročila gosto agregacijo DNK raka, kar je preprečilo agregacijo cist/AuNP. Posledično so bili ti nanodelci popolnoma razpršeni v zunanjih plasteh rakavih agregatov, kar je povzročilo drugačno disperzijo Cyst/AuNP, adsorbiranih na normalnih in rakavih agregatih DNA. Krivulje ROC so bile nato ustvarjene s spreminjanjem praga od najmanjše vrednosti ΔA650/525 do največje vrednosti.

Slika 2. (a) Relativne vrednosti absorbance raztopin cist/AuNP, ki kažejo prisotnost normalne (modre) in rakaste (rdeče) DNK v optimiziranih pogojih

(DA650/525) škatlastih ploskev; (b) Analiza ROC in ocena diagnostičnih testov. (c) Matrika zmede za diagnozo normalnih bolnikov in bolnikov z rakom. (d) Občutljivost, specifičnost, pozitivna napovedna vrednost (PPV), negativna napovedna vrednost (NPV) in točnost razvite metode.

Kot je prikazano na sliki 2b, je območje pod krivuljo ROC (AUC = 0,9274), pridobljeno za razviti senzor, pokazalo visoko občutljivost in specifičnost. Kot je razvidno iz okvirnega grafa, najnižja točka, ki predstavlja normalno skupino DNK, ni dobro ločena od najvišje točke, ki predstavlja skupino DNK raka; zato je bila za razlikovanje med normalnimi in rakavimi skupinami uporabljena logistična regresija. Glede na nabor neodvisnih spremenljivk oceni verjetnost pojava dogodka, kot je rak ali normalna skupina. Odvisna spremenljivka se giblje med 0 in 1. Rezultat je torej verjetnost. Določili smo verjetnost identifikacije raka (P) na podlagi ΔA650/525, kot sledi.

kjer je b=5,3533,w1=-6,965. Za razvrstitev vzorcev verjetnost, manjša od 0,5, pomeni normalen vzorec, medtem ko verjetnost 0,5 ali višja pomeni vzorec raka. Slika 2c prikazuje matriko zmede, ustvarjeno iz navzkrižne validacije, ki je bila uporabljena za potrditev stabilnosti metode razvrščanja. Slika 2d povzema oceno diagnostičnega testa metode, vključno z občutljivostjo, specifičnostjo, pozitivno napovedno vrednostjo (PPV) in negativno napovedno vrednostjo (NPV).

Biosenzorji na osnovi pametnega telefona

Za dodatno poenostavitev testiranja vzorcev brez uporabe spektrofotometrov so raziskovalci uporabili umetno inteligenco (AI) za interpretacijo barve raztopine in razlikovanje med normalnimi in rakavimi posamezniki. Glede na to je bil računalniški vid uporabljen za prevajanje barve raztopine Cyst/AuNPs v normalno DNK (vijolično) ali rakasto DNK (rdečo) z uporabo slik plošč s 96 jamicami, posnetih s kamero mobilnega telefona. Umetna inteligenca lahko zmanjša stroške in izboljša dostopnost pri razlagi barv raztopin nanodelcev in brez uporabe kakršnih koli optičnih dodatkov za pametne telefone. Nazadnje sta bila dva modela strojnega učenja, vključno z Random Forest (RF) in Support Vector Machine (SVM), usposobljena za izdelavo modelov. oba modela RF in SVM sta pravilno razvrstila vzorce kot pozitivne in negativne z natančnostjo 90,0 %. To nakazuje, da je uporaba umetne inteligence pri biosenzorju na osnovi mobilnih telefonov povsem možna.

Slika 3. (a) Ciljni razred raztopine, zabeležen med pripravo vzorca za korak pridobivanja slike. (b) Primer slike, posnete med korakom pridobivanja slike. (c) Intenzivnost barve raztopine ciste/AuNPs v vsaki vdolbinici plošče s 96 vdolbinicami, ekstrahirane iz slike (b).

Z uporabo Cyst/AuNP so raziskovalci uspešno razvili preprosto senzorsko platformo za odkrivanje krajine metilacije in senzor, ki je sposoben razlikovati normalno DNK od DNK raka pri uporabi resničnih vzorcev krvi za presejanje levkemije. Razviti senzor je pokazal, da je DNK, ekstrahirana iz vzorcev resnične krvi, lahko hitro in stroškovno učinkovito odkrila majhne količine DNK raka (3 nM) pri bolnikih z levkemijo v 15 minutah in pokazala natančnost 95,3 %. Za dodatno poenostavitev testiranja vzorcev z odpravo potrebe po spektrofotometru je bilo uporabljeno strojno učenje za interpretacijo barve raztopine in razlikovanje med normalnimi in rakavimi posamezniki s pomočjo fotografije mobilnega telefona, natančnost pa je bila dosežena tudi pri 90,0 %.

Sklic: DOI: 10.1039/d2ra05725e