Testiranje metilacije DNK v kombinaciji s pametnimi telefoni za zgodnje odkrivanje tumorjev in levkemije z natančnostjo 90,0 %!

Zgodnje odkrivanje raka na podlagi tekoče biopsije je nova smer odkrivanja in diagnosticiranja raka, ki jo je v zadnjih letih predlagal ameriški Nacionalni inštitut za raka, s ciljem odkrivanja zgodnjega raka ali celo predrakavih lezij. Široko se uporablja kot nov biomarker za zgodnjo diagnozo različnih malignomov, vključno z rakom pljuč, tumorji prebavil, gliomi in ginekološkimi tumorji.

Pojav platform za identifikacijo biomarkerjev metilacijske krajine (Methylscape) ima potencial, da znatno izboljša obstoječe zgodnje presejalne preglede za raka, s čimer bi bolnike postavil v najzgodnejšo ozdravljivo fazo.

Raziskovalci so nedavno razvili preprosto in neposredno platformo za zaznavanje metilacijske krajine, ki temelji na zlatih nanodelcih, okrašenih s cisteaminom (Cyst/AuNP), v kombinaciji z biosenzorjem na pametnem telefonu, ki omogoča hitro zgodnje odkrivanje širokega spektra tumorjev. Zgodnje odkrivanje levkemije se lahko izvede v 15 minutah po ekstrakciji DNK iz vzorca krvi z natančnostjo 90,0 %. Naslov članka je Hitro odkrivanje rakave DNK v človeški krvi z uporabo AuNP, okrašenih s cisteaminom, in pametnega telefona s strojnim učenjem.

Slika 1. Preprosto in hitro platformo za zaznavanje za presejanje raka prek komponent Cyst/AuNPs je mogoče doseči v dveh preprostih korakih.

To je prikazano na sliki 1. Najprej je bila za raztapljanje fragmentov DNK uporabljena vodna raztopina. Nato so bile mešani raztopini dodane ciste/AuNP. Normalna in maligna DNK imata različne lastnosti metilacije, kar ima za posledico fragmente DNK z različnimi vzorci samosestavljanja. Normalna DNK se rahlo agregira in sčasoma agregira ciste/AuNP, kar povzroči rdeč premik cist/AuNP, tako da je spremembo barve iz rdeče v vijolično mogoče opaziti s prostim očesom. Nasprotno pa edinstven profil metilacije rakave DNK vodi do nastanka večjih grozdov fragmentov DNK.

Slike 96-jamičnih plošč so bile posnete s kamero pametnega telefona. Rakavo DNK so merili s pametnim telefonom, opremljenim s strojnim učenjem, v primerjavi z metodami, ki temeljijo na spektroskopiji.

Presejalni testi za raka v vzorcih resnične krvi

Da bi razširili uporabnost platforme za zaznavanje, so raziskovalci uporabili senzor, ki je uspešno razlikoval med normalno in rakavo DNK v resničnih vzorcih krvi. Vzorci metilacije na mestih CpG epigenetsko uravnavajo izražanje genov. Pri skoraj vseh vrstah raka so opazili izmenične spremembe v metilaciji DNK in s tem v izražanju genov, ki spodbujajo tumorogenezo.

Kot model za druge vrste raka, povezane z metilacijo DNK, so raziskovalci uporabili vzorce krvi bolnikov z levkemijo in zdravih kontrolnih oseb, da bi raziskali učinkovitost metilacijske krajine pri razlikovanju med levkemičnimi raki. Ta biomarker metilacijske krajine ne le presega obstoječe metode hitrega presejanja levkemije, temveč tudi dokazuje izvedljivost razširitve na zgodnje odkrivanje širokega spektra vrst raka z uporabo tega preprostega in enostavnega testa.

Analizirana je bila DNK iz vzorcev krvi 31 bolnikov z levkemijo in 12 zdravih posameznikov. Kot je prikazano na okvirnem diagramu na sliki 2a, je bila relativna absorbanca vzorcev raka (ΔA650/525) nižja kot pri DNK iz normalnih vzorcev. To je bilo predvsem posledica povečane hidrofobnosti, ki je vodila do goste agregacije rakave DNK, kar je preprečilo agregacijo Cyst/AuNP. Posledično so bili ti nanodelci popolnoma dispergirani v zunanjih plasteh agregatov raka, kar je povzročilo različno disperzijo Cyst/AuNP, adsorbiranih na agregate normalne in rakave DNK. ROC krivulje so bile nato ustvarjene s spreminjanjem praga od minimalne vrednosti ΔA650/525 do maksimalne vrednosti.

Slika 2.(a) Relativne vrednosti absorbance raztopin cist/AuNPs, ki kažejo prisotnost normalne (modra) in rakave (rdeča) DNK v optimiziranih pogojih

(DA650/525) škatlastih diagramov; (b) ROC analiza in vrednotenje diagnostičnih testov. (c) Matrika zmede za diagnozo normalnih in rakavih bolnikov. (d) Občutljivost, specifičnost, pozitivna napovedna vrednost (PPV), negativna napovedna vrednost (NPV) in natančnost razvite metode.

Kot je prikazano na sliki 2b, je površina pod ROC krivuljo (AUC = 0,9274), dobljena za razviti senzor, pokazala visoko občutljivost in specifičnost. Kot je razvidno iz škatlastega diagrama, najnižja točka, ki predstavlja normalno skupino DNK, ni dobro ločena od najvišje točke, ki predstavlja skupino rakave DNK; zato je bila za razlikovanje med normalno in rakavo skupino uporabljena logistična regresija. Glede na nabor neodvisnih spremenljivk oceni verjetnost nastanka dogodka, kot je rak ali normalna skupina. Odvisna spremenljivka se giblje med 0 in 1. Rezultat je torej verjetnost. Verjetnost identifikacije raka (P) smo določili na podlagi ΔA650/525 na naslednji način.

kjer je b=5,3533, w1=-6,965. Pri razvrščanju vzorcev verjetnost manjša od 0,5 kaže na normalen vzorec, medtem ko verjetnost 0,5 ali več kaže na vzorec z rakom. Slika 2c prikazuje matriko zmede, ki je nastala z navzkrižno validacijo »leave-it-alone«, ki je bila uporabljena za potrditev stabilnosti metode razvrščanja. Slika 2d povzema oceno diagnostičnega testa metode, vključno z občutljivostjo, specifičnostjo, pozitivno napovedno vrednostjo (PPV) in negativno napovedno vrednostjo (NPV).

Biosenzorji na osnovi pametnih telefonov

Za nadaljnjo poenostavitev testiranja vzorcev brez uporabe spektrofotometrov so raziskovalci uporabili umetno inteligenco (UI) za interpretacijo barve raztopine in razlikovanje med normalnimi in rakavimi posamezniki. Glede na to so uporabili računalniški vid za pretvorbo barve raztopine Cyst/AuNPs v normalno DNK (vijolična) ali rakavo DNK (rdeča) z uporabo slik 96-jamičnih plošč, posnetih s kamero mobilnega telefona. Umetna inteligenca lahko zmanjša stroške in izboljša dostopnost pri interpretaciji barve raztopin nanodelcev, in to brez uporabe kakršne koli optične strojne opreme za pametne telefone. Nazadnje sta bila za izdelavo modelov usposobljena dva modela strojnega učenja, vključno z naključnim gozdom (RF) in podpornim vektorskim strojem (SVM). Oba modela RF in SVM sta pravilno razvrstila vzorce kot pozitivne in negativne z natančnostjo 90,0 %. To kaže, da je uporaba umetne inteligence pri biosenzorjenju na osnovi mobilnih telefonov povsem mogoča.

Slika 3.(a) Ciljni razred raztopine, posnet med pripravo vzorca za korak zajemanja slike. (b) Primer slike, posnete med korakom zajemanja slike. (c) Intenzivnost barve raztopine cist/AuNPs v vsaki vdolbinici 96-vdolbinske plošče, izvlečene iz slike (b).

Z uporabo Cyst/AuNP so raziskovalci uspešno razvili preprosto platformo za zaznavanje metilacijske krajine in senzor, ki je sposoben razlikovati normalno DNK od rakave DNK pri uporabi vzorcev resnične krvi za presejanje levkemije. Razviti senzor je pokazal, da je DNK, ekstrahirana iz vzorcev resnične krvi, lahko hitro in stroškovno učinkovito zaznala majhne količine rakave DNK (3 nM) pri bolnikih z levkemijo v 15 minutah in pokazala natančnost 95,3 %. Za nadaljnjo poenostavitev testiranja vzorcev z odpravo potrebe po spektrofotometru je bilo uporabljeno strojno učenje za interpretacijo barve raztopine in razlikovanje med normalnimi in rakavimi posamezniki z uporabo fotografije mobilnega telefona, natančnost pa je bila dosežena tudi pri 90,0 %.

Referenca: DOI: 10.1039/d2ra05725e