Moteči dejavniki pri reakcijah PCR

Med reakcijo PCR se pogosto pojavijo nekateri moteči dejavniki.
Zaradi zelo visoke občutljivosti PCR se kontaminacija šteje za enega najpomembnejših dejavnikov, ki vpliva na rezultate PCR in lahko povzroči lažno pozitivne rezultate.
Enako kritični so različni viri, ki vodijo do lažno negativnih rezultatov. Če je eden ali več bistvenih delov mešanice PCR ali sama reakcija pomnoževanja zavirana ali motena, je lahko diagnostični test oviran. To lahko povzroči zmanjšano učinkovitost in celo lažno negativne rezultate.
Poleg inhibicije lahko pride do izgube celovitosti ciljne nukleinske kisline zaradi pogojev pošiljanja in/ali shranjevanja pred pripravo vzorca. Zlasti visoke temperature ali neustrezno shranjevanje lahko povzročijo poškodbe celic in nukleinskih kislin. Fiksacija celic in tkiv ter vdelava v parafin sta dobro znana vzroka za fragmentacijo DNK in stalen problem (glej sliki 1 in 2). V teh primerih niti optimalna izolacija in čiščenje ne bosta pomagali.

Slika 1 | Vpliv imobilizacije na celovitost DNK
Elektroforeza v agaroznem gelu je pokazala, da je kakovost DNK, izolirane iz parafinskih delov obdukcij, precej različna. V izvlečkih je bila glede na metodo fiksacije prisotna DNK različnih povprečnih dolžin fragmentov. DNK se je ohranila samo, če je bila fiksirana v nativno zamrznjenih vzorcih in v pufriranem nevtralnem formalinu. Uporaba močno kislega Bouinovega fiksativa ali nepuferiranega formalina, ki vsebuje mravljično kislino, je povzročila znatno izgubo DNK. Preostala frakcija je močno razdrobljena.
Na levi je dolžina fragmentov izražena v kilobaznih parih (kbp)

Slika 2 | Izguba celovitosti tarč nukleinskih kislin
(a) 3′-5′ vrzel na obeh verigah bo povzročila prelom v ciljni DNA. sinteza DNA bo še vedno potekala na majhnem fragmentu. Če pa na fragmentu DNA manjka mesto žarjenja primerja, pride le do linearnega pomnoževanja. V najbolj ugodnem primeru se lahko fragmenti drug drugega ponovno nasičijo, vendar bodo izkoristki majhni in pod ravnmi zaznave.
(b) Izguba baz, predvsem zaradi depurinacije in tvorbe dimerja timidina, povzroči zmanjšanje števila H-vezi in zmanjšanje Tm. Med podaljšano fazo segrevanja se bodo primerji odtalili od matrične DNK in se ne bodo žarili niti pod manj strogimi pogoji.
(c) Sosednje baze timina tvorijo dimer TT.
Druga pogosta težava, ki se pogosto pojavlja pri molekularni diagnostiki, je manj kot optimalno sproščanje ciljnih nukleinskih kislin v primerjavi s fenol-kloroformsko ekstrakcijo. V skrajnih primerih je to lahko povezano z lažno negativnimi rezultati. Veliko časa je mogoče prihraniti z lizo pri vrenju ali encimsko razgradnjo celičnih ostankov, vendar ta metoda pogosto povzroči nizko občutljivost PCR zaradi nezadostnega sproščanja nukleinske kisline.

Zaviranje aktivnosti polimeraze med pomnoževanjem

Na splošno se inhibicija uporablja kot vsebniški koncept za opis vseh dejavnikov, ki vodijo do neoptimalnih rezultatov PCR. V strogo biokemičnem smislu je inhibicija omejena na aktivnost encima, tj. zmanjša ali prepreči pretvorbo substrat-produkt z interakcijo z aktivnim mestom DNA polimeraze ali njenega kofaktorja (npr. Mg2+ za Taq DNA polimerazo).
Komponente v vzorcu ali različni pufri in ekstrakti, ki vsebujejo reagente, lahko neposredno zavirajo encim ali ujamejo njegove kofaktorje (npr. EDTA), s čimer inaktivirajo polimerazo in posledično povzročijo zmanjšane ali lažno negativne rezultate PCR.
Vendar pa so številne interakcije med reakcijskimi komponentami in nukleinskimi kislinami, ki vsebujejo tarčo, označene tudi kot "zaviralci PCR". Ko je celovitost celice porušena z izolacijo in se nukleinska kislina sprosti, lahko pride do interakcij med vzorcem in okoliško raztopino ter trdno fazo. Na primer, 'lovilci' lahko vežejo eno- ali dvoverižno DNK z nekovalentnimi interakcijami in motijo ​​izolacijo in čiščenje z zmanjšanjem števila tarč, ki na koncu dosežejo reakcijsko posodo PCR.
Na splošno so zaviralci PCR prisotni v večini telesnih tekočin in reagentov, ki se uporabljajo za klinične diagnostične preiskave (sečnina v urinu, hemoglobin in heparin v krvi), prehranskih dopolnilih (organske sestavine, glikogen, maščobe, Ca2+ ioni) in sestavinah v okolju (fenoli , težke kovine)

Bolj razširjene zaviralce PCR lahko najdemo v bakterijah in evkariontskih celicah, netarčni DNA, makromolekulah, ki vežejo DNA, tkivnih matrik in laboratorijski opremi, kot so rokavice in plastika. Čiščenje nukleinskih kislin med ali po ekstrakciji je prednostna metoda za odstranjevanje zaviralcev PCR.
Danes lahko različna oprema za avtomatizirano ekstrakcijo nadomesti številne ročne protokole, vendar 100-odstotna predelava in/ali čiščenje tarč ni bilo nikoli doseženo. Morebitni zaviralci so lahko še vedno prisotni v prečiščenih nukleinskih kislinah ali pa so že začeli učinkovati. Obstajajo različne strategije za zmanjšanje učinka zaviralcev. Izbira ustrezne polimeraze lahko pomembno vpliva na aktivnost inhibitorja. Druge dokazane metode za zmanjšanje inhibicije PCR so povečanje koncentracije polimeraze ali uporaba dodatkov, kot je BSA.
Inhibicijo reakcij PCR je mogoče dokazati z uporabo notranjega nadzora kakovosti procesa (IPC).
Paziti je treba, da odstranite vse reagente in druge raztopine v kompletu za ekstrakcijo, kot so etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol in fenol, s korakom temeljitega pranja iz izolata nukleinske kisline. Odvisno od koncentracije lahko aktivirajo ali zavirajo PCR.