Moteči dejavniki v reakciji PCR

Med reakcijo PCR se pogosto srečujejo z nekaterimi motečimi dejavniki.
Zaradi zelo velike občutljivosti PCR se šteje, da je kontaminacija eden najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na rezultate PCR in lahko dajo lažno pozitivne rezultate.
Prav tako kritični so različni viri, ki vodijo do lažno negativnih rezultatov. Če je eden ali več bistvenih delov mešanice PCR ali sama amplifikacijska reakcija zavirana ali vmešana, lahko diagnostični test oviramo. To lahko privede do zmanjšane učinkovitosti in celo napačnih negativnih rezultatov.
Poleg inhibicije se lahko zaradi odpreme in/ali shranjevanja pred pripravo vzorca pojavi izguba ciljne nukleinske kisline. Zlasti visoke temperature ali neustrezno skladiščenje lahko privedejo do poškodb celic in nukleinskih kislin. Fiksacija celic in tkiv ter vdelava parafinov sta dobro znani vzroki za fragmentacijo DNK in vztrajni problem (glej sliki 1 in 2). V teh primerih celo optimalna izolacija in čiščenje ne bosta pomagala.

Slika 1 | Vpliv imobilizacije na celovitost DNK
Elektroforeza z agaroznim gelom je pokazala, da se je kakovost DNK, izolirane iz parafinskih odsekov obdukcij, precej razlikovala. DNK različnih povprečnih dolžin fragmentov je bila prisotna v izvlečkih, odvisno od metode fiksacije. DNK je bila ohranjena le, če je bila pritrjena v domačih zamrznjenih vzorcih in v pufranem nevtralnem formalinu. Uporaba močno kislega bouinskega fiksalnega ali neobremenjenega formalina, ki vsebuje mravljično kislino, je povzročila znatno izgubo DNK. Preostali del je zelo razdrobljen.
Na levi se dolžina fragmentov izraža v parih kilobaz (KBP)

Slika 2 | Izguba celovitosti ciljev nukleinske kisline
(a) 3 '-5' vrzel na obeh pramenih bo povzročil prelom ciljne DNK. Sinteza DNK se bo še vedno pojavila na majhnem fragmentu. Če pa na fragmentu DNK manjka mesto za žarjenje temeljnega premaza, pride do samo linearne amplifikacije. V najbolj ugodnem primeru se lahko fragmenti medsebojno resutirajo, vendar bodo donosi majhni in pod stopnjo odkrivanja.
(b) Izguba baz, predvsem zaradi nastajanja dimera in timidina, vodi do zmanjšanja števila H-vezi in zmanjšanja TM. Med podolgovato fazo segrevanja se bodo temeljni premazi stopili stran od matrične DNK in ne bodo žalili niti pod manj strogimi pogoji.
(c) sosednje timinske baze tvorijo TT dimer.
Druga pogosta težava, ki se pogosto pojavlja pri molekularni diagnostiki, je manj kot optimalno sproščanje ciljnih nukleinskih kislin v primerjavi z ekstrakcijo fenol-kloroform. V skrajnih primerih je to lahko povezano z lažnimi negativi. Veliko časa je mogoče shraniti z vrelo lizo ali encimsko prebavo celičnih naplavin, vendar ta metoda pogosto povzroči nizko občutljivost PCR zaradi nezadostnega sproščanja nukleinske kisline.

Inhibicija aktivnosti polimeraze med amplifikacijo

Na splošno se inhibicija uporablja kot koncept zabojnikov za opis vseh dejavnikov, ki vodijo do suboptimalnih rezultatov PCR. V strogo biokemičnem smislu je inhibicija omejena na aktivnost encima, tj. Zmanjša ali preprečuje pretvorbo substratnih proizvodov z interakcijo z aktivnim mestom polimeraze DNA ali njegovega kofaktorja (npr. Mg2+ za TAQ DNA polimerazo).
Sestavni deli v vzorcu ali različnih puferjih in ekstrakti, ki vsebujejo reagente, lahko neposredno zavirajo encim ali ujamejo njegove kofaktorje (npr. EDTA), s čimer se inaktivirajo polimerazo in posledično vodijo do zmanjšanih ali napačnih negativnih rezultatov PCR.
Vendar pa so številne interakcije med reakcijskimi komponentami in nukleinskimi kislinami, ki vsebujejo ciljne, označene tudi kot „zaviralci PCR“. Ko se celovitost celice moti z izolacijo in se sprosti nukleinska kislina, se lahko pojavijo interakcije med vzorcem in njegovo okoliško raztopino ter trdno fazo. Na primer, "čistilci" lahko z nekovalentnimi interakcijami vežejo eno- ali dvojno verižno DNK in motijo ​​izolacijo in čiščenje z zmanjšanjem števila tarč, ki sčasoma dosežejo reakcijsko posodo PCR.
Na splošno so zaviralci PCR prisotni v večini telesnih tekočin in reagentov, ki se uporabljajo za klinične diagnostične teste (sečnina v urinu, hemoglobinu in heparinu v krvi), prehranskih dopolnil (organske sestavine, glikogena, maščob, Ca2+ ions) in sestavnih delov v okolju (fenoli, težke metale)

Bolj razširjene zaviralce PCR najdemo v bakterijah in evkariontskih celicah, neciljnih DNK, makromolekulah, ki vežejo DNA, in laboratorijske opreme, kot so rokavice in plastika. Čiščenje nukleinskih kislin med ali po ekstrakciji je najprimernejša metoda za odstranjevanje zaviralcev PCR.
Danes lahko različne avtomatizirane opreme za ekstrakcijo nadomestijo številne ročne protokole, vendar 100 -odstotno okrevanje in/ali čiščenje ciljev nikoli ni bilo doseženo. Potencialni zaviralci so lahko še vedno prisotni v prečiščenih nukleinskih kislinah ali so že začeli veljati. Obstajajo različne strategije za zmanjšanje vpliva zaviralcev. Izbira ustrezne polimeraze lahko pomembno vpliva na aktivnost zaviralcev. Druge dokazane metode za zmanjšanje inhibicije PCR povečujejo koncentracijo polimeraze ali uporabo aditivov, kot je BSA.
Inhibicijo reakcij PCR lahko dokažemo z uporabo notranjega nadzora kakovosti procesa (IPC).
Paziti je treba, da odstranite vse reagente in druge rešitve v kompletu ekstrakcije, kot so etanol, EDTA, Cetab, LICL, GUSCN, SDS, izopropanol in fenol, iz izolacije nukleinske kisline s temeljitim korakom pranja. Glede na njihovo koncentracijo lahko aktivirajo ali zavirajo PCR.