Med PCR reakcijo se pogosto pojavijo nekateri moteči dejavniki.
Zaradi zelo visoke občutljivosti PCR velja kontaminacija za enega najpomembnejših dejavnikov, ki vplivajo na rezultate PCR, in lahko povzroči lažno pozitivne rezultate.
Enako pomembni so različni viri, ki vodijo do lažno negativnih rezultatov. Če je eden ali več bistvenih delov PCR mešanice ali sama reakcija amplifikacije zavrta ali motena, je lahko diagnostični test oviran. To lahko privede do zmanjšane učinkovitosti in celo lažno negativnih rezultatov.
Poleg inhibicije lahko pride do izgube integritete ciljne nukleinske kisline zaradi pogojev pošiljanja in/ali shranjevanja pred pripravo vzorca. Zlasti visoke temperature ali neustrezno shranjevanje lahko povzročijo poškodbe celic in nukleinskih kislin. Fiksacija celic in tkiv ter vgradnja v parafin sta dobro znana vzroka za fragmentacijo DNK in vztrajna težava (glej sliki 1 in 2). V teh primerih niti optimalna izolacija in čiščenje ne bosta pomagali.
Slika 1 | Vpliv imobilizacije na celovitost DNK
Elektroforeza na agaroznem gelu je pokazala, da se kakovost DNK, izolirane iz parafinskih rezin obdukcij, precej razlikuje. V ekstraktih je bila prisotna DNK z različnimi povprečnimi dolžinami fragmentov, odvisno od metode fiksacije. DNK se je ohranila le, če je bila fiksirana v nativnih zamrznjenih vzorcih in v puferiranem nevtralnem formalinu. Uporaba močno kislega Bouinovega fiksativa ali nepuferiranega formalina, ki vsebuje mravljinčno kislino, je povzročila znatno izgubo DNK. Preostala frakcija je zelo fragmentirana.
Na levi je dolžina fragmentov izražena v kilobaznih parih (kbp)
Slika 2 | Izguba integritete nukleinskih kislinskih tarč
(a) 3′-5′ vrzel na obeh verigah bo povzročila prekinitev ciljne DNK. Sinteza DNK bo še vedno potekala na majhnem fragmentu. Če pa na fragmentu DNK manjka mesto vezave začetnih oligonukleotidov, pride le do linearne amplifikacije. V najugodnejšem primeru se lahko fragmenti medsebojno ponovno nasičijo, vendar bodo izkoristki majhni in pod ravnmi detekcije.
(b) Izguba baz, predvsem zaradi depurinacije in nastajanja timidinskega dimera, vodi do zmanjšanja števila vodikovih vezi in zmanjšanja Tm. Med podaljšano fazo segrevanja se bodo začetni oligonukleotidi stopili od matrične DNK in se ne bodo vezali niti v manj strogih pogojih.
(c) Sosednje timinske baze tvorijo TT dimer.
Druga pogosta težava, ki se pogosto pojavlja v molekularni diagnostiki, je manj kot optimalno sproščanje ciljnih nukleinskih kislin v primerjavi z ekstrakcijo s fenol-kloroformom. V skrajnih primerih je to lahko povezano z lažno negativnimi rezultati. Z lizo z vrenjem ali encimsko razgradnjo celičnih ostankov je mogoče prihraniti veliko časa, vendar ta metoda pogosto povzroči nizko občutljivost PCR zaradi nezadostnega sproščanja nukleinskih kislin.
Inhibicija aktivnosti polimeraze med amplifikacijo
Na splošno se inhibicija uporablja kot skupni koncept za opis vseh dejavnikov, ki vodijo do neoptimalnih rezultatov PCR. V strogo biokemičnem smislu je inhibicija omejena na aktivnost encima, tj. zmanjšuje ali preprečuje pretvorbo substrata v produkt z interakcijo z aktivnim mestom DNA polimeraze ali njenega kofaktorja (npr. Mg2+ za Taq DNA polimerazo).
Komponente v vzorcu ali različni pufri in ekstrakti, ki vsebujejo reagente, lahko neposredno zavirajo encim ali ujamejo njegove kofaktorje (npr. EDTA), s čimer inaktivirajo polimerazo in posledično povzročijo zmanjšane ali lažno negativne rezultate PCR.
Vendar pa se številne interakcije med reakcijskimi komponentami in nukleinskimi kislinami, ki vsebujejo tarče, imenujejo tudi "zaviralci PCR". Ko izolacija poruši integriteto celice in se nukleinska kislina sprosti, lahko pride do interakcij med vzorcem in okoliško raztopino ter trdno fazo. Na primer, "lovilci" se lahko vežejo na eno- ali dvoverižno DNA z nekovalentnimi interakcijami in motijo izolacijo in čiščenje z zmanjšanjem števila tarč, ki sčasoma dosežejo reakcijsko posodo PCR.
Na splošno so zaviralci PCR prisotni v večini telesnih tekočin in reagentov, ki se uporabljajo za klinične diagnostične teste (sečnina v urinu, hemoglobin in heparin v krvi), prehranskih dopolnilih (organske komponente, glikogen, maščobe, ioni Ca2+) in komponentah v okolju (fenoli, težke kovine).
Inhibitorji | Vir |
Kalcijevi ioni | Mleko, kostno tkivo |
Kolagen | Tkivo |
Žolčne soli | Iztrebki |
Hemoglobin | V krvi |
Hemoglobin | Vzorci krvi |
Huminska kislina | Tla, rastlina |
Kri | Kri |
Laktoferin | Kri |
(evropski) melanin | Koža, lasje |
Mioglobin | Mišično tkivo |
Polisaharidi | Rastlina, iztrebki |
Proteaza | Mleko |
Sečnina | Urin |
Mukopolisaharid | Hrustanec, sluznice |
Lignin, celuloza | Rastline |
Pogostejši inhibitorji PCR so v bakterijah in evkariontskih celicah, neciljni DNK, makromolekulah tkivnih matric, ki vežejo DNK, in laboratorijski opremi, kot so rokavice in plastika. Čiščenje nukleinskih kislin med ali po ekstrakciji je najprimernejša metoda za odstranjevanje inhibitorjev PCR.
Danes lahko različna avtomatizirana oprema za ekstrakcijo nadomesti številne ročne protokole, vendar 100-odstotna regeneracija in/ali čiščenje tarč še nikoli ni bila dosežena. Potencialni inhibitorji so lahko še vedno prisotni v prečiščenih nukleinskih kislinah ali pa so že začeli učinkovati. Obstajajo različne strategije za zmanjšanje vpliva inhibitorjev. Izbira ustrezne polimeraze lahko pomembno vpliva na aktivnost inhibitorjev. Druge preizkušene metode za zmanjšanje inhibicije PCR so povečanje koncentracije polimeraze ali uporaba dodatkov, kot je BSA.
Zaviranje reakcij PCR je mogoče dokazati z uporabo notranjega nadzora kakovosti procesa (IPC).
Paziti je treba, da iz izolata nukleinske kisline s temeljitim izpiranjem odstranite vse reagente in druge raztopine v kompletu za ekstrakcijo, kot so etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol in fenol. Glede na njihovo koncentracijo lahko aktivirajo ali zavirajo PCR.
Čas objave: 19. maj 2023